Sarah Chalke comenzó su carrera a los ocho años apareciendo en producciones de teatro musical. Hizo su debut como actriz en la película para televisión Chico de ciudad (1992). En 1993, se mudó a Estados Unidos para asumir el papel de Rebecca Conner-Healy en la famosa serie Roseanne después de que Lecy Goranson dejara la serie. En 1998, un año después del final de Roseanne, Sarah fue elegida para actuar en el programa Nothing Too Good for a Cowboy (1998). El programa se basó en la película para televisión del mismo nombre, Nothing Too Good for a Cowboy (1998), en la que también participó. En 2001, fue elegida como la Dra. Elliot Reid en la serie de comedia Scrubs de la NBC, en la que fue miembro del elenco durante las nueve temporadas hasta que la serie terminó en 2010. Apareció como personaje secundario en Chaos Theory (2007), protagonizada por el canadiense Ryan Reynolds, y desde el 2013 da voz al personaje de Beth Smith en Rick y Morty. En 2021 protagoniza junto a Katherine Heigl la nueva serie de Netfilx El baile de las luciérnagas.