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El primer papel de Jordana Spiro fue como Catherine Reece en la película de 1999, From Dusk Till Dawn 3: The Hangman's Daughter, una precuela estrenada directamente en DVD de la película de 1996 Del crepúsculo al amanecer. Después apareció en varias series como invitada hasta que en 2006 obtuvo el papel protagónico en la comedia original de TBS My Boys, en la que desempeñó el papel de P.J., una chica de veintitantos años, y reportera de deportes, que intenta encontrar un romance dentro de su mundo dominado por amigos varones. La serie terminó su cuarta y última temporada en 2010. Spiro también apareció en la comedia Duro de vender (2009) junto a Jeremy Piven, Ed Helms y Rob Riggle, y producida por Will Ferrell y Adam McKay. Después de dirigir algunos cortos, estrenó su primer largometraje Night Comes On, que dirigió y coescribió con Angelica Nwandu, en el Festival de Cine de Sundance en 2018. Spiro interpretó a Rachel Garrison en las primeras dos temporadas del drama criminal de Netflix Ozark.
