Eve Best asistió al Lincoln College de Oxford, donde estudió inglés y apareció en producciones de la Sociedad Dramática de la Universidad de Oxford. Hizo su debut profesional como Beatrice en Mucho ruido y pocas nueces en el Southwark Playhouse. Best se formó en la Royal Academy of Dramatic Art (RADA) de Londres de donde se graduó en 1999. Siguió una exitosa carrera en teatro y, en 2006, ganó el Premio Olivier a la Mejor Actriz por interpretar el papel principal en Hedda Gabler. Hizo su debut en Broadway en la reposición de 2007 de A Moon for the Misbegotten, ganando el premio Drama Desk a la mejor actriz en una obra y recibiendo la primera de dos nominaciones al premio Tony a la mejor actriz en una obra; la segunda fue por la reactivación de The Homecoming en 2008. En televisión, es conocida por su papel como la Dra. Eleanor O'Hara en la serie Nurse Jackie (2009-2013) y próximamente la veremos como Rhaenys Velaryon en House of the Dragon.