Alessandra Mastronardi asistió a un Liceo Clásico y luego a la Universidad Sapienza de Roma, donde estudió artes escénicas. Debutó como actriz en 1997, en la miniserie Un prete tra noi, seguida de papeles en diferentes películas. Mastronardi ganó más popularidad en Italia, cuando se convirtió en miembro regular del elenco de la versión italiana de la serie de televisión Los Serrano, I Cesaroni(2006-2014), en la que interpreta el papel de la joven tímida y romántica Eva Cudicini. Mastronardi llegó a un público internacional cuando interpretó a Milly, una joven novia y profesora de astronomía, en la película de Woody Allen de 2012, De Roma con amor. En el 2017, apareció como el personaje de Francesca en la temporada 2 de Master of None de Netflix. Próximamente la podremos ver en El peso del talento, una película protagonizada por Nicolas Cage interpretando una versión ficticia de él mismo, quien lucha por conectarse con su hija mientras busca su próximo gran proyecto.