La temporada 4 comienza con Horatio confesando a un sacerdote sobre un asesinato que tuvo lugar hace más de 20 años en Nueva York. Pero su tranquila confesión se ve interrumpida por disparos en un cementerio cerca de la iglesia. De vuelta en el laboratorio, Natalie Boa Vista, una técnica experta en ADN especializada en casos fríos, comienza a trabajar y llama la atención de Eric Delko y Ryan Wolfe. Otra mujer que llama la atención de Ryan es la agresiva reportera de televisión Erica Sikes, quien demuestra ser una espina clavada en su costado. Más tarde, el futuro de Ryan como CSI corre peligro cuando recibe un disparo con una pistola de clavos en el rabillo del ojo derecho. En cuanto a Horatio, su novia Rachel es asesinada y él se convierte en sospechoso en el caso.