Lee Seo-jin hizo su debut como actor en 1999 en la serie de televisión House Above the Waves. Después de varios papeles secundarios en la televisión, saltó a la fama en el exitoso drama de época de 2003 Damo, seguido del también popular drama contemporáneo Phoenix (2004). Luego, Lee obtuvo su primer papel protagónico en la pantalla grande en el éxito de taquilla de acción de 2005 Shadowless Sword. A lo largo de los años, Lee también se destacó en los dramas Lovers (2006), Yi San (2007) y Contrato matrimonial (2016). El actor también se volvió conocido por los programas de telerrealidad Three Meals a Day (2014-2015) y Grandpa Over Flowers (2013-2015). Actualmente podemos verlo en Jinny’s Kitchen (2023) es una serie derivada del popular programa de telerrealidad Youn’s Kitchen que presenta un nuevo restaurante dirigido por Lee Seo Jin, con un elenco conformado por Jung Yu Mi, Park Seo Joon, Choi Woo Shik y V de BTS.