Sullivan Stapleton se unió a una agencia de modelaje a los ocho años y empezó a hacer comerciales. Después de participar en un cortometraje, el director lo alentó a perseguir formalmente una carrera actoral. Su primera actuación en pantalla fue en la película para televisión australiana de 1994 Baby Bath Massacre. Entre trabajos de actuación modeló, limpió jaulas de animales en una tienda de mascotas y trabajó como asistente en muchas películas y producciones de televisión. Recibió entrenamiento en el St. Martin's Theatre de Melbourne y estudió drama y teatro en Sandringham Secondary College. En la televisión australiana ganó popularidad por los papeles de Josh Hughes en la telenovela Neighbours (1998) y Justin Davies en la serie The Secret Life of Us (2003-2005). Stapleton interpretó el papel principal, el líder griego Themistocles, en la película 300: El nacimiento de un imperio (2014), y entre 2015 y 2020 interpretó al agente Kurt Weller en la serie Blindspot de la NBC.