Desde pequeño, Rodrigo de la Serna se interesó por el teatro, y participó en las obras del taller de su escuela. Cuando terminó el secundario ya trabajaba profesionalmente. En 1995 empezó su carrera televisiva. Apareció en numerosas series, sin embargo, De la Serna se hizo más conocido gracias a su protagónico en la miniserie Okupas (Canal 7), que contaba la vida de barrios marginales. En 2004 interpretó el papel de Alberto Granado, el compañero de viaje del Che Guevara durante su viaje de 8 meses a través de América del Sur en la película Diarios de motocicleta. Por esta actuación, De la Serna ganó el Condor de plata al mejor actor y el Premio Independent Spirit a la Mejor interpretación debut, y fue nominado al Premio BAFTA al Mejor actor de reparto y al Globo de oro. En 2019 se integró al elenco de la tercera temporada de la aclamada serie La Casa de Papel de Netflix, interpretando al personaje Palermo.